Media merupakan faktor utama dalam perbanyakan dengan kultur jaringan. Keberhasilan perbanyakan dan perkembangbiakan tanaman dengan metode kultur jaringan secara umum sangat tergantung pada jenis media. Media tumbuh pada kultur jaringan sangat besar pengaruhnya terhadap pertumbuhan dan perkembangan eksplan serta bibit yang dihasilkannya. Oleh karena itu, macam-macam media kultur jaringan telah ditemukan sehingga jumlahnya cukup banyak. Nama-nama media tumbuh untuk eksplan ini biasanya sesuai dengan nama penemunya. Media tumbuh untuk eksplan berisi kualitatif komponen bahan kimia yang hampir sama, hanya agak berbeda dalam besarnya kadar untuk tiap-tiap persenyawaan. Media dasar yang sering digunakan dalam kultur jaringan Anthurium sendiri adalah media MS dan modifikasinya ( Pierik et al.,1974; Pierik dan Steegmans, 1976;Kunisaki, 1980; Kuenhle et al., 1992; Chen et al; Hamidah et al., 1997; Teng, 1997;2 ; Rachmawati, 2005), media Nitsch dan modifikasinya (Geir, 1986, 1987, 1988).
Pada umumnya komposisi utama media tanam kultur jaringan, terdiri dari hormon (zat pengatur tumbuh) dan sejumlah unsur yang biasanya terdapat di dalam tanah yang dikelompokkan ke dalam unsur makro, unsur mikro. Hasil yang lebih baik akan dapat kita peroleh bila, kedalam media tersebut, ditambahkan vitamin, asam amino, dan hormon, bahan pemadat media (agar), glukosa dalam bentuk gula maupun sukrosa, air destilata (akuades), dan bahan organik tambahan (Gunawan, 1992).
Gula digunakan sebagai sumber energi dalam media kultur, karena umumnya bagian tanaman atau eksplan yang dikulturkan tidak autotrof dan mempunyai laju fotosintesis yang rendah. Oleh sebab itu tanaman kultur jaringan membutuhkan karbohidart yang cukup sebagai sumber energi. Menurut Gautheret dalam Gunawan (1992), sukrosa adalah sumber karbohidrat penghasil energi yang terbaik melebihi glukosa, maltosa, rafinosa. Namun jika tidak terdapat sukrosa, sumber karbohidrat tersebut dapat digantikan dengan gula pasir. Gula pasir cukup memenuhi syarat untuk mendukung pertumbuhan kultur. Selain sebagai sumber energi, gula juga berfungsi sebagai tekanan osmotik media.
Eksplan yang dikulturkan harus selalu bersinggungan atau terkena dengan medianya. Bahan pemadat media yang paling banyak digunakan adalah agar-agar. Agar-agar adalah campuran polisakarida yang diperoleh dari beberapa spesies algae. Dalam analisa unsur, diperoleh data bahwa agar-agar mengandung sedikit unsur Ca, Mg, K, dan Na (Debergh, 1982 dalam Gunawan, 1992). Keuntungan dari pemakaian agar-agar adalah :
1. Agar-agar membeku pada suhu 45° C dan mencair pada suhu 100° sehingga dalam kisaran suhu kultur, agar-agar akan berada dalam keadaan beku yang stabil.
2. Tidak dicerna oleh enzim tanaman.
3. Tidak bereaksi dengan persenyawaan-persenyawaa penyusun media.
Selain agar-agar, bahan pemadat media yang semakin banyak disukai adalah Gelrite TM (buatan Kelco). Gelrite adalah gellam gum, suatu hetero-polisakarida yang dihasilkan bakteri Pseudomonas elodea, terdiri dari molekul-molekul K-glukuronat, rhamnosa, dan selobiosa. Sebagai bahan pemadat media gelrite memiliki sifat-sifat yang menguntungkan sebagai berikut :
1) Gelnya lebih jernih.
2) Untuk memadatkan media dibutuhkan lebih sedikit daripada agar, sekitar 1,5 -3 g/l.
3) Lebih murni dan konsisten dalam kualitas.
4) Untuk mencapai kekerasan gel tertentu, pemakaian gelrite lebih rendah dari agar-agar, pada umumnya 2gr/l media. Namun kekerasan gel dari gelrite sangat dipengaruhi oleh kehadiran garam-garam seperti NaCl, KCl, MgCl2.6H2O dan CaCl2. Garam NaCl dan KCl menurunkan kekerasan gel, tetapi MgCl2 dan CaCl2 meningkatkan kekerasan gel (Gunawan, 1992; 57 ).
Salah satu kelemahan Gelrite adalah cenderung menaikkan kelembaban nisbi (RH) dalam kultur, sehingga sering menyebabkan terjadinya verifikasi. Gelrite jarang digunakan untuk produksi planlet secara komersial terutama di Indonesia karena harganya mahal (Yusnita, 2003).
Kultur yang kurang berhasil, kadang-kadang disebabkan oleh pemakaian air yang kurang murni (Wetherel, 1976). Tidak boleh sembarang air dapat digunakan untuk membuat media kultur. Contohnya air sumur atau air ledeng, dalam air tersebut mengandung banyak kontaminan, bahan inorganik, organik, atau mikroorganisme. Air yang digunakan untuk membuat media harus benar-benar berkualitas tinggi, karena air maliputi lebih adari 95% komponen media. Terhambatnya pertumbuhan tanaman yang dikulturkan dapat disebabkan oleh rendahnya kualitas air yang digunakan. Untuk menghindari hal tersebut, maka sebaiknya digunakan air yang telah dimurnikan atau yang sering kita sebut air destilata (akuades) atau air destilata ganda (akuabides). Dengan alasan ini, sebaiknya sebuah laboratorium kultur jaringan layaknya mempunyai alat penyulingan air (water destilator) atau setidaknya alat pembuat air bebas ion (deionizer). Cara kerja destilator dalam menghasilkan air destilata adalah dengan cara mengubah air menjadi uap air, kemudian mengkondensasikan uap air tersebut. Maka, jadilah air destilata yang tidak lagi berisi mineral atau senyawa organik (Yusnita, 2004).
Keasaman (pH) adalah nilai yang menyatakan derajat keasaman atau kebasaan larutan dalam air. Sel-sel tanaman yang dikembangkan dengan teknik kultur jaringan mempunyai toleransi pH yang relatif sempit dengan titik optimal antara pH 5,0 – 6,0 (Daisy, 1994). Faktor pH dalam media juga perlu mendapat perhatian khusus. pH tesebut harus diatur sedemikian rupa sehingga tidak mengganggu fungsi membran sel dan pH dari sitoplasma. Pengaturan pH selain memperhatikan kepentingan beberapa fisiologi sel, juga harus mempertimbangkan faktor-faktor:
1) Kelarutan dari garam-garam penyusun media.
2) Pengambilan (uptake) dari zat pengatur tumbuh dan garam – garam lain.
3) Efisiensi pembekuan agar-agar.
Menurut Gamborg dan Shyluk, 1981 dalam Gunawan, 1992, sel-sel tanaman membutuhkan pH yang sedikit asam berkisar antara 5,5–5,8. Pengaturan pH, biasa dilakukan dengan dengan menggunakan NaOH (atau kadang-kadang KOH) atau HCL pada waktu semua komponen sudah dicampurkan (Gunawan, 1992).
Menyiapkan media
Sebelum membuat medium, maka terlebi dahulu kita harus menentukan medium apa yang akan kita buat. Jenis medium dengan komposisi unsur kimia yang berbeda dapat digunakan untuk media tumbuh dari jaringan tanaman yang berbeda pula. Misalnya media Vacin Went sangat baik untuk media tumbuh anggrek. Tetapi tidak cocok untuk media tumbuh lain. Untuk eksplan dair tanaman keras sring menggunakan medium WPM, sedangkan untuk tanaman semusim (sayuran dan tanaman hias) sering menggunakan medium MS. Medium Kundson C cocok untuk menanam eksplan kelapa kopyor dan anggrek.
Untuk membuat media kultur jaringan, biasanya menimbang setiap komponen bahan kimia yang terdapat pada resep medium dasar. Langkah ini kurang praktis karena memakan banyak waktu dan mengurangi ketepatan. Selain itu, timbangan yang digunakan untuk menimbang sejumlah kecil bahan kimia kadang-kadang tidak tersedia. Kendala ini dapat diatasi dengan membuat larutan stoc terlebih dahulu, kecuali untuk unsur makronya. Jadi perlu membuat larutan stoc mikro.
Media persiapan agak tergantung pada jenis spesies tanaman Anda mencoba untuk dimasukkan ke dalam kultur jaringan. Banyak spesies tanaman dapat dibudidayakan pada kekuatan penuh Murashige dan Skoog (MS) dengan vitamin. Untuk tanaman karnivora, yang terbaik untuk menggunakan 1 / 2 atau 1 / 3 MS dengan vitamin. Ada, tentu saja, jenis lain media yang dapat bekerja dengan baik, tetapi untuk mudahnya, mari kita bahas menggunakan MS.
Bentuk Fisik Media Tanam
Media tanam harus berisi semua zat yang diperlukan untuk menjamin pertumbuhan eksplan. Bahan-bahan yang diramu berisi campuran garam mineral sumber unsur makro dan unsur mikro, gula , vitamin, protein, dan hormon tumbuh. media tanam dalam kultur jaringan adalah tempat untuk tumbuh eksplan. Media tanam tersebut dapat berupa larutan (cair) atau padat. Media cair berarti campuran-campuran zat kimia dengan air suling, sedangkan media padat adalah media zat cair tesebut ditambah dengan zat pemadat agar.
Faktor Lingkungan
Keasaman (pH)
Keasaman pH adalah nilai derazat keasaman atau kebasaan dari larutan dalam air. Keasaman (pH) suatu larutan menyatakan kadar dari ion H dalam larutan. Nilai di dalam pH berkisar antara 0 (sangat asam) sampai 14 (sangat basa), sedangkan titk netral adalah pH pada 7.
Sel-sel tanaman yang dikembangkan dengan teknik kultur jaringan mempunyai toleransi pH yang relatif sempit dengan titik optimal antara pH 5,0-6,0. Bila eksplan mulai tumbuh, pH dalam lingkungan kultur jaringan tanaman umumnya akan naik apabila nutrein habis terpakai.
Pengukuran pH dapat dilakukan dengan menggunakan pH meter, atau bila menginginkan yang lebih praktis dan murah dapat digunakan kertas pH. Bila ternyata pH medium masih kurang normal, maka dapat ditambah KOH 1-2 tetes. Sedangkan apabila pH melampaui batas normal dinetralkan dengan penambahan HCL.
Kelembapan
Kelembapan relatif (RH) lingkungan biasanya mendekati 100%. RH sekeliling kultur mempengaruhi pola pengembangan. Jadi, pengaturan RH pada keadaan tertentu memerlukan suatu bentuk diferensiasi Khusus.
Cahaya
Intensitas cahaya yang rendah dapat mempertinggi embriogenesis dan organogenesis. Cahaya ultra violet dapat mendorong pertumbuhan dan pembentukan tunas dari kalus tembakau pada intesitas yang rendah.
Temperatur
Temperatur yang dibutuhkan untuk dapat terjadi pertumbuhan yang optimum umumnya adalah berkisar di antara 200-300C. Sedangkan temperatur yang optimum untuk pertumbuhan kalus endosperm adalah sekitas 250C.
Bahan-bahan
Bahan untuk menyiapkan 1 liter muscipula Dionaea (Venus perangkap terbang) sedang:
1 / 2 MS medium dengan vitamin (satu setengah dari paket 1 liter atau 2,2 gram). Kebanyakan Kultur Jaringan teknisi menggunakan 1 / 3 MS untuk tanaman karnivora dengan hasil yang bagus.
2 sendok makan gula meja (sekitar 30g)
1 ml BAP (1 mg / ml) - meninggalkan ini keluar untuk benih. Itu bahkan opsional untuk eksplan. Dionaea eksplan akan membentuk kalus tanpa itu.
1 ml PPM
Agar
Air suling
Cuka dan baking soda.
Langkah-langkah untuk membuat media:
1. Isi 1 liter atau 1 liter wadah dengan 3 gelas air.
2. Tambahkan media MS (1 / 2 paket atau 2,2 gram) dan 2 sendok makan gula pasir dan aduk rata.
3. Ukur 1 ml BAP dan 1ml PPM dan menambahkannya ke solusi.
4. Tambahkan pewarna makanan (jika diinginkan) untuk menunjukkan media BAP.
5. Tambahkan air cukup untuk membawa campuran media untuk tepat 1 liter
6. Test pH. Sebuah pH antara 5 dan 6 lebih disukai dengan 5,6-5,8 optimal menjadi.
Jika pH terlalu rendah ("asam") menambahkan sejumlah SANGAT kecil baking soda untuk solusi, remix dengan baik dan remeasure.
Jika pH terlalu tinggi ("dasar") tambahkan beberapa tetes cuka untuk solusi, remix dengan baik dan remeasure.
Terus lakukan ini sampai Anda mencapai pH yang diinginkan.
7. Setelah pH yang diinginkan tercapai, mulai pengeluaran media ke guci makanan bayi. (Catatan: Beberapa orang menambahkan agar-agar yang pertama, tetapi dalam pengalaman saya ini menyebabkan beberapa stoples terlalu lunak sementara yang lain hard rock aku telah menemukan lebih baik untuk menambahkan agar-agar setelah pengeluaran.). Anda bisa meletakkan ml 25ml atau 50 ke dalam botol masing-masing.
8. Tambahkan agar-agar ke guci. Untuk 25 ml media, saya menggunakan "sedikit" sesendok dan untuk 30ml untuk 50ml saya menggunakan "sejumput" sesendok baik tingkat (untuk 30ml) atau penumpukan (untuk 50ml). Catatan: Anda juga dapat menambahkan agar-agar atau agen gelling lain (Gelcarin GP812, dll) ke media sebelum mengeluarkan ke wadah makanan bayi. Agar tidak larut dalam air pada suhu ruang sehingga Anda harus panas media untuk dekat mendidih untuk membubarkan itu. Gelcarin larut dalam air pada suhu kamar, sehingga Anda dapat menambahkan sebelum mengeluarkan. Untuk aplikasi yang paling saya menggunakan antara 6g dan 8g agen gelling per liter media.
9. Tutup guci dan menempatkan mereka di pressure cooker, microwave atau perangkat autoclave lainnya dalam persiapan untuk sterilisasi.
Media sterilisasi
Karena Anda akan mempersiapkan media di dapur atau area kerja Anda di udara terbuka, media akan hampir pasti memiliki kontaminan di dalamnya, termasuk bakteri dan / atau spora jamur. Dalam rangka untuk mencegah kontaminasi dari "crash" atau mengambil alih budaya dan tumbuh melampaui jaringan yang lain di dalamnya, Anda harus mensterilkan media
Media sterilisasi bisa dilakukan di microwave atau di pressure cooker. Aku hanya pernah menggunakan pressure cooker karena, menurut pendapat saya, itu metode yang jauh lebih handal. Jika menggunakan microwave, Anda dapat berakhir mendidih media atas atau tidak mendapatkan itu disterilkan sepenuhnya. Ada garis halus Anda harus berjalan ketika menggunakan microwave, jadi aku baru saja menghindarinya. A pressure cooker, di sisi lain, memberikan suhu stabil dan tekanan yang akan membunuh spora. Setiap pressure cooker standar diatur untuk bekerja di 15 PSI. Beberapa model yang lebih baik memiliki kontrol tekanan sehingga Anda dapat mengatur mereka untuk berjalan pada tekanan yang berbeda. Untuk tujuan media sterilisasi, 15 PSI adalah sempurna. Jumlah waktu untuk menjalankan kompor tekanan tergantung pada berapa banyak media yang Anda miliki dalam setiap guci. Saya biasanya meletakkan 30ml untuk 40 ml media dalam setiap jar dan menjalankan pressure cooker selama 25 menit.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar